适于SDS_PAGE分析的苹果叶片蛋白质提取方法

华北农学报 2009,24(2):75 78

适于SDS-PAGE分析的苹果叶片蛋白质提取方法

曾广娟1,2,李春敏2,张新忠3,陈东玫2,赵永波2,董文轩1

(1.沈阳农业大学园艺学院,辽宁沈阳 110161;2.河北省农林科学院昌黎果树研究所,

河北昌黎 066600;3.中国农业大学园艺植物研究所,北京 100193)

摘要:为探索苹果叶片蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的样品制备方法,比较了三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法、改良的Tris-HCl法、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法、二硫苏糖醇(DTT)/丙酮法及Tris-HCl法等5种蛋白质的提取方法。制备的样品经SDS-PAGE分离采用银染显色。结果表明,改良的Tris-HCl法在加大PVPP用量和蛋白质提取缓冲液的基础上,将丙酮沉淀蛋白质的时间由30min增加到1h,使蛋白质的得率最高为3.243 g/ L,上样量5 L得到的蛋白质条带数量最多,条带最清晰为41条。利用这一改良方法对苹果实生树不同节位蛋白质的动态变化进行了研究,共发现6条蛋白质差异带,分子量分别为71.9,60.5,52.6,41.1,35.3,18.5kDa,条带清楚,背景清晰。因此,改良的Tris-HCl法适用于苹果叶片的SDS-PAGE分析。

关键词:苹果;SDS-PAGE;蛋白质提取

中图分类号:S661.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)02-0075-04

LeafProteinExtractionMethodsSuitableforSDS-PAGEAnalysisinApple

ZENGGuang-juan1,2,LIChun-min2,ZHANGXin-zhong3,

CHENDong-mei2,ZHAOYong-bo2,DONGWen-xuan1

(1.CollegeofHorticulture,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang 110161,China;2.ChangliInstituteofPomology,HebeiAcademyofAgricultureandForestryScience,Changli 066600,China;

3.InstituteforHorticulturalPlants,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing 100193,China)

Abstract:InordertodevelopanefficientproteinextractionmethodsuitableforSDS-PAGEanalysis,fiveprotocolsforproteinextractioninappleleaf,trichloroaceticacid/acetoneprecipitation(TCA),modifiedTris-HClextraction,phe nolextractionmethanol/ammoniumacetateprecipitation,DTT/acetoneandTris-HClextractionwerecompared.Theex tractswereseparatedbySDS-PAGEmethodfollowedbysilverstaining.TheresultsshowedthatthemodifiedTris-HClextractionpresentedthehighestresolutionof3.243 g/ Landthemaximumbandsof41stripswiththe5 Lsamplevol umesbasingontheincreasedamountofPVPPandtheextractingsolutionaswellasprolonged30minofproteinprecipita tionwithcoldacetone.Dynamicchangesofproteinsinleavesfromdifferentnodesinappleseedlings(Jonathan GoldenDelicious)wereanalyzedwiththeimprovedTris-HClextractionmethod,sixproteinbandsweredetectedwiththemolec ularweight71.9,60.5,52.6,41.1,35.3,18.5kDarespectivelyandthebandswereclearwithalightbackground.SotheimprovedTris-HClextractionwasthemostappropriatemethodforappleleafSDS-PAGEanalysis。

Keywords:Apple;SDS-PAGE;Extraction 苹果叶片蛋白质含量较低,且富含多酚、色素及多糖等干扰物质,这些物质给蛋白质样品制备带来了困难,使可溶性蛋白质的数目大大减少。植物蛋白质样品制备中,增加蛋白质洗涤次数能提高

[1-3]

电泳结果的质量,但常常导致一些蛋白质丢失。植物组织常用的蛋白质提取方法是三氯乙酸/丙酮沉淀法,只是目前尚没有对所有的植物样品都适用的蛋白质样品制备方法[5]。因而,

适于SDS_PAGE分析的苹果叶片蛋白质提取方法