蛋白质SDS-PAGE电泳注意事项

匀浆：

1. 匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。

2. SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。

3. 所有操作尽量在冰上进行。

4. 94℃水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事先要打开升温）。

5. PMSF是有毒试剂，处理时注意。

6. 操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。

7. 热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到4℃，即可。

8. 离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。

9. SDS,DDT,PMSF是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。制胶：

10. APS和TEMED是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30％。

11. 玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。

12. 丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。）

13. 1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm的玻璃板用白色条带封底。（封紧以防漏胶）

14. 凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。

15. 样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。一般要5-10分钟。而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。

16. 点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。（点在边上时，跑出的带是斜的）

17. 点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。

18. 开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。

19. 电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）

20. 脱色时，尽量多次进行换水。

21. 上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl.

22. 做胶时，凝胶时间控制在25min。梳子不能歪来歪去。

23. 上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。

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