常见重组蛋白纯化方法

常见重组蛋白的纯化

韦新桂(Chromatography) 北京韦氏博慧色谱科技有限公司，doc.guandang.net,

前言：

近年来随着生物技术的进步，特别是基因工程的迅猛发展，表达蛋白已经变得很容易，相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达，这样纯化相对得比较容易，即使如此，由于蛋白的多样性，纯化依然是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉纯化的研究者而言，它成为一个项目的瓶颈，本手册就是把一些相关的材料汇集，希望对纯化重组蛋白有所帮助。

1．1常见纯化的标签

最好能一步纯化得到纯品；2和活性没有影响；3方便切除标签；4 但是没有哪个标签是完美的，只能根据实际需要去自己筛选，下表是部分的标签以及纯化的方案： 标签

多聚组氨酸（6XHis）

谷胱甘肽硫转酶（GST）

麦芽糖结合蛋白（MBP）

Flag peptide 纯化用的填料或配基 螯合镍、铜、钴离子的填料 淀粉琼脂糖凝胶 抗Flag抗体 ,M1,M2 洗脱方法 咪唑或降低pH 麦芽糖 低pH 低pH或EDTA

高盐

乙二醇

盐酸胍或脲

巯基乙醇，半胱氨酸 键合谷胱甘肽的亲和填料还原谷胱甘肽 金黄色葡萄球菌蛋白琼脂糖凝胶 多聚精氨酸（Poly-Arg）琼脂糖凝胶 多聚苯丙氨酸（Poly-Phe） 苯基琼脂糖凝胶 钙调蛋白结合肽 纤维素结合域 几丁质结合域 纤维素 几丁质 多聚半胱氨酸（Poly-Cys） 活化巯基琼脂糖凝胶钙调蛋白

由于篇幅有限，手册只只写多聚组氨酸标签、GST融合蛋白。

2． 组氨酸标签蛋白的纯化

His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。

2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发