血浆载脂蛋白ApoAI的分离纯化

生物技术专业课实验

血浆载脂蛋白A-I（ApoA-I）的分离纯化

[目的与要求]

掌握并提高生化实验基本原理及技术；了解生物大分子分离方案的设计及路径；培养生物化学领域的科研设计的能力。

[原理]

生物大分子主要是指蛋白质、酶、多糖和核酸。迄今已知的生物大分子的分离纯化方法很多，主要利用它们之间特异性的差异，如分子量大小、分子形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷和对其它分子的亲和力等建立起来的。其主要原理基本可归纳为两个方面，一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两相或多相中，如盐析、盐溶、有机溶剂沉淀、共沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于单一的物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。目前纯化蛋白质的3种关键方法是电泳、超速离心和层析。由于生物大分子不能加热熔化、汽化，所能分配的物相只限于固相和液相、并在这两相之间交替进行分离纯化。因此，可将生物大分子制备方法按分子大小和形状、带电性质、溶解度、酸碱性、对其它分子的亲和力等主要因素分类（见下表）。

性质

分子大小和形状

溶解度

电荷差异

生物功能专一性 具体方法 差速离心、超滤、分子筛、透析 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等 电泳、等电聚焦、离子交换层析、吸附层析 亲和层析、疏水层析、共价层析

在实际工作中，往往综合使用上述几种方法才能制备出一种纯化的生物大分子。 分离纯化生物大分子总希望纯度好、产率高，但实际上，两者不能兼得。因此考虑分离纯化条件和方法时，不得不在两者间作适当的选择。一般，科研上更多考虑纯度，工业生产上更多选择产率。

在进行实践前，应进行充分的调查研究，查阅有关文献资料，对自己欲分离纯化的物质的物理、化学及生物学性质先有一定的了解，然后进行实验工作。对于一个未知的生物大分子试样进行创造性的分离纯化时，首先要确定研究的主要目的。如分离纯化肽类物质或酶类等，可参考已有的肽类或酶类物质分离纯化方法进行反复的摸索比较，找到一些工作规律，逐步达到预期的结果。在分离纯化工作中，另一重要工作是建立相应的分析鉴定方法及生物活性测定方法，即对目的活性物质跟踪分析，以便正确指导分离纯化工作一步步顺利深入进行，若要提纯一生物大分子达到一定纯度，一般要经过多种方法、步骤和不断变化操作条件才能达到目的，因此，整个实验过程中，各种方法的优劣，选择条件其效果的好坏，均需通过分析鉴定和生物活性测定来判断。

生物大分子一般需经过下列步骤（或其中几个步骤）才能分离纯化达到所需的要求。

一、前处理 包括生物材料的选择及处理、细胞破碎、细胞器分离及目的物提取。 选材主要根据实验目的而定，从工业生产角度选材，注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物材料原料。科研角度选材，则只需符合实验预定目标的要求即可。材料选定后，必须尽可能保持新鲜，尽快加工处理。如不立即进行实验或加工，则应冷冻保存。

若材料是提取液、体液（如血）、代谢排出液（如尿）、细胞外某些多肽激素、蛋白质、酶等则不需破碎细胞。若为细胞内生物活性物质则需细胞破碎，如科研上材料处理量少，则可用匀浆器或超声波处理法破碎；若处理材料量较大，则可用高速组织捣碎机。操作时，将