《生物工程下游技术实验》项目一(08生工9-11周实验计划)

下游技术几个重要实验流程,苦逼的生物生你们都懂的!!

《生物工程下游技术实验》讲义

广州大学生命科学学院 柯德森、巫锦雄

2010年10月10日

实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术”

(共3个独立时间段,每次6节课，第八周开始)

实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时)

过程

1. 每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。

2. 所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至40%饱和度（查一般实验手册,约

22.6g/100ml清液），5℃ 冰箱中静置备用下一实验。

SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理） 邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。 NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。

一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法

溶液配制：

1， 连苯三酚：630 mg------ 100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。共配500ml. 2， pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl：

A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液)

B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储备液)

0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml..

操作：

25 C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 l 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（ Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（ Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的 Ａ’在0.035/min左右。（以上 Ａ Ａ’的变化值不需特别严格， Ａ只要控制在0.1以下0.04以上， Ａ’变化在 Ａ的约一半左右即可）