H5亚型AIV诱导组织细胞凋亡的TUNEL检测

细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在一定的生理或病理条件下,按照其自身的程序,自已逐渐结束其生命的历程,通常最后细胞脱落离体,或者裂解为若干个凋亡小体而被其他细胞吞噬。随着对细胞凋亡研究和认识的不断深入。检测细胞凋亡的方法也不断更新和多样化。Gavrieli Y等(1992)首先建立的TUNEI。方法,该方法特别适合于组织切片的细胞凋亡原位检测。

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中1医杂志 2o兽 0 6年 ( 4第 2卷 ) 8期第

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H5亚型 AI诱导组织细胞凋亡的 T L检测 V UNE 曹伟胜！,罗开健。张桂红， ! !任涛 .辛朝安 .廖明一一 ( .南农业大学兽医学院 .东广州 5 6:2农业部养禽与禽病防治重点开放实验室 .广东广州 5 1 ) 1华广 1 1 0 2 . 1 6 0 2中图分类号： 8 2 3￥ 5 .文献标识码： B文章编号： 5 9 6 0 ( 0 6 0 0 0 0 2—0 5 2 0 )8O 1-2 7

细胞凋亡 (p p o i)指细胞在一定的生理或 a o ts是 s

AI Z株， VS由农业部养禽与禽病防治重点开发实验室鉴定纯化。并置于一8 (保存。 0、 1 2实验动物 1日龄石岐杂黄羽肉鸡购于华南 .农业大学动物科学院实验禽场。农业部养禽与禽在病防治重点实验室的负压实验动物房隔离器中饲养至2 8日龄。实验动物隔离饲养期间不做任何疫苗的免疫，也不添加任何药物。试验前取血清进行 HI试验和 A GP试验。无禽流感抗体者用于本研究。 1 3主要试剂 I i l De t tcin Ki . n St Cel a h Dee to t u

病理条件下，照其自身的程序，按自已逐渐结束其生命的历程，常最后细胞脱落离体，通或者裂解为若十 个凋亡小体而被其他细胞吞噬‘。随着对细胞凋亡 研究和认识的不断深入。测细胞凋亡的方法也小检

断更新和多样化。Ga r l Y等 ( 9 )先建立的 vii e 1 2首 9 T UNE方法，方法特别适合于组织切片的细胞 I该凋亡原位检测一。 。

在生理条件下。细胞凋亡是个受严格控制的细 胞死亡事件。而在不同病原感染宿主细胞的过程中，

( (D) P )和蛋白酶 K均为 R c eD a n si mb o h i o t sG H g c 公司产品。即用型 DAB为丹麦 D AK(公司产品。 )

常常伴有细胞凋亡现象。有多种病毒可以诱导宿主细胞的凋亡，人免疫缺陷病毒。鸡传染性贫血如、。和病毒一。研究发现不同来源 A型流感病毒均可诱导 多种细胞培养或组织细胞的

细胞凋亡。‘ ~。

1×多聚赖氨酸为美国 Maxm公司产品。 0 ii

1 4组织切片制备 .

将1 0只2 8日龄实验鸡随机分

成 2组，攻毒试验组和非攻毒对照组各 5只鸡。其中试验组每只鸡经点眼滴鼻途径接种 0 2ml1 0 . ×1 i ED I的 AI Z毒株。对照组经相同途径接种 V S

A型流感病毒不仅可诱导体外培养的细胞凋亡；而且还可诱导活体动物细胞的细胞凋亡 7。目前有关禽流感病毒引起的活体动物组织细胞凋亡的报道较少。林祥梅等 ( 0 0曾利用鸭源禽流感病毒 20 )

0 2ml .正常鸡胚尿囊液。在感染后 ( o tifcin P s net, o P ) 6h经颈静脉放血剖杀，即取出心、、、 I 3立肝脾

( N?经滴鼻一眼一腔注射途径人工感染 5周 Hg )点腹龄来航鸡后观察诱导的细胞凋亡情况，果发现 P 结 I 3天时肾脏的细胞凋亡率最高，次分别是脾、其胸腺和法氏囊等淋巴器官，另外心脏、脏和肺等组织器肝官也表现出显著的凋亡一。IoT等 ( 0 2分别用 t 20) H7、 N1和 HS N7HS N3亚型高致病性禽流感病毒经

肺、、腺、氏囊、脑和胰腺等组织后 .速置肾胸法大迅于1 0倍于组织块体积以上的 4多聚甲醛溶液中。 按常规方法制备 5f石蜡组织切片。 m 1 5组织切片的 T . UNE 色 I染的使用说明书进行，稍作改进。并 参照瑞士 R c e o h 公司 I i e e t tcinKi( OD)剂盒 nSt C l D ahDeet tP u l o试

滴鼻途径接种 5周龄白色来航鸡细胞凋亡情况，发 现 3天后叮引起 j龄白色来航鸡的肾、腺、周胰肝脏千脑的血管内皮细胞出现显著的 TⅡ UNE阳性信 I号。本研究将利用 TUNE 法检测石岐杂黄鸡 I方

1 6计算凋亡指数和统计学分析计数每种组织 . 20 0 0个细胞中的凋亡阳性细胞数，然后计算出百分

率，利用 t验法检查对照组与试验组的差异显再检著性。根据下面的公式计算出凋亡指数。凋亡指数 ( )一定范围内凋亡细胞阳性数÷细胞总数 ) 一(× 1OO

人工感

染 H5 N1亚型高致病性禽流感病毒后不同组织器官的细胞捌亡情况，这对于研究H5亚型禽流感 病毒对鸡的致病机理有重要意义。

2结果与分析 1材料与方法

2 1 AI Z株人工感染鸡后的临床观察实验 . VS 11病毒 . A/ oe GD/ Z 1 9 ( N1简称 Go s/ S 7 H5 ) 9鸡经点眼滴鼻途径接种AI Z株后 3,表现精 VS 6h鸡神不振、欲和饮欲下降、毛松乱等临床症状。而食羽 对照组无异常表现。

收稿 H期： 0 6( 7 2 O 1 0 6

荩金项日：家自然科学荩金 ( O O l 6 3 2 0 8 )国家科技罔 3 l0 3 .0 79 7 .攻关项口 ( 0)B l A1 . 0 4 A5 A1 )广东省自然科学基金 2 (1 A5 2 o B 1 9 9 9 6、[项日( 2 o 3 )广东省自然科学基金 ( 3 0 3 )广东省科技攻硐队 5o68 . 5085 .父项目( ( 3 0 o . 0)A2 9 l 1 2) A2 4 3 2 ( 0 I 000 )作者简介：伟胜 ( 7 )男 .师， f.寄预防医学研曾 1 5,讲 9博一从 f E mal c o iha cl. d c i:a wes ( I e u. n u

2 2 AI Z株人工感染鸡后的组织细胞凋亡观 . VS察将 AI Z株经点眼滴鼻途径人工感染 4周龄 VS实验鸡 3 6h后 .各组织器官的细胞凋亡情况见表 1。与对照组的实验鸡相比。验组除了脑组织没有发试

通【f} 1:}、 i ml o c u e u c L 廖{ F mal i@{ . d . n J】: a l