分子生物学综述

游泳

聚合酶链反应技术在肿瘤病理研究中的应用

分子生物学理论、方法出现的革命性创新并日臻完善,使生物医学进入分子时代,也将病理学带入分子病理学时代,对疾病的病因、发生、发展、发病机制及形态变化,从传统形态学概念深入至分子或基因水平,其中以肿瘤分子病理研究是最为热点的领域,，聚合酶链反应技术是目前常用的肿瘤的分子病理学的方法之

一。聚合酶链反应( PCR) 技术是一种快速的体外扩增DNA 技术。PCR 技术应用于肿瘤的检测为肿瘤病理学研究提供了有效研究方法，推动了病理学的发展。 1实时定量PCR 检测IgH 重排在B 淋巴细胞恶性肿瘤中的应用

自1985 年PCR 技术问世以来定量PCR 技术应用于癌基因检测等方面。定量PCR 也经历了从粗略定量，半定量到精确定量，绝对定量的发展过程。通常采用极限倍比稀释，竞争PCR 等对基因进行定量检测。但这些方法步骤烦琐，费时，费力，且有易污染，不准确，灵敏度不够等缺点。荧光探针实时定量PCR 较好的解决了上述问题。它是在普通的PCR 体系中加入了一个能与靶基因结合的双荧光标记探针。 其5'端标有一个荧光报告基团3'端标有荧光淬灭基团。在PCR复性延伸阶段Taq酶利用其5'，3' 外切酶活性将5' 端荧光报告基团切下，使其解除了3'端淬灭基团的淬灭作用而发射荧光。被释放的荧光信号与PCR 产物成比例增长，通过检测PCR 过程中的荧光变化即可得知产物数量的信息[2]。为了消除PCR 前很多步骤对定量的影响， 常采用一些生物体内稳定存在的基因如β-actin（β肌动蛋白）GAPDH（ 3-磷酸甘油醛脱氢酶）等作内参照。 根据各自检测结果得出待测基因的相对浓度（待测基因浓度/ 参照物浓度） [3,4]。用此法检测IgH 重排的难度在于其重排是多种多样的，不可能用单一的引物和探针进行扩增。一般实验过程为：用IgH 基因中的保守序列设计共有引物（consensus primers）扩增出标本中的肿瘤克隆，对其测序，根据测序结果为每个病例设计一条克隆特异性的TaqMan 探针，再配合一端或两端的ASO（ Allele’ specific oligonucleotides）引物进行RQ- PCR[5]。 从而排除其他B细胞克隆的干扰，对肿瘤克隆进行准确定量。RQ- PCR 就像一把非常有用的尺子，而尺子的刻度必须由标准品来确定， 所以标准品的状况越接近样品越理想。理想的实验是将每个患者的肿瘤克隆扩增产物克隆到质粒中， 用含有目的基因的质粒倍比稀释后作为标准品[4]。 在ALL（ 急性淋巴细胞白血病）MRD 的研究中，也有人采用初诊时的骨髓作标准品。