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荧光定量PCR引物设计
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer
有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关 看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效
看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。
看所用扩增基因是否为组织特异性表达
看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整
设好内参正对照
最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，
（1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率
（2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染
（3）两条引物的Tm值不要相差太大
（4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上（一般Tm=80以下的峰都是引物二聚体），对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。
（3）相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的3'端不要有错配。
（5）一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之内可以搞定一个基因。
实时定量PCR引物设计的具体要求
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