鹅副粘病毒实时荧光定量RT_PCR检测方法的建立

试验综述

鹅副粘病毒实时荧光定量RT-PCR

检测方法的建立

张桐源1，林

颖2，耿庆华2，龙朕1，林书铭2，赵玉军1*

沈阳

110866；

110016）

1672-9692(2011)05-0063-03

（1．沈阳农业大学，辽宁

中图分类号

S855.3

文献标识码

A

2．沈阳出入境检验检疫局，辽宁沈阳

文章编号

!!!!!"

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"

[摘要]根据GenBank所载鹅副粘病毒（GPMV）的F基因保守区序列设计一对特异性引物，应用RT-PCR方法扩增F基因片段，克隆、测序后，采取Taqman探针法建立了检测鹅副粘病毒的荧光RT-PCR方法。结果表明，该方法特异性强，敏感性高，可以用于鹅副粘病毒的检测。

[关键词]鹅副粘病毒；Taqman探针法；荧光RT-PCR

!!!!!"

弥漫性纤维性结痂溃疡为主要病变特征的新的病毒性传染病。鹅副粘病毒（GPMV）属禽Ⅰ型副粘病毒，病毒颗粒为单股RNA病毒，有囊膜，表面有密集的纤突结构。不同日龄的鹅对该病均能感染，且日龄越小，发病率、死亡率越高，15日龄内的幼鹅死亡率可达100%。因此，建立一套准确、快速、敏感的诊断方法是必不可少的。本研究采用Taqman探针法，以GPMV的F基因序列设计了一对特异性引物和探针，利用基因克隆技术，将一段长度为1700bp的GPMV片段克隆到质粒载体中，并对其进行实时荧光定量PCR检测，从而建立了一种对鹅副粘病毒荧光

［收稿日期］２０１１－０３－２２

［作者简介］张桐源（１９８５－），沈阳农业大学预防兽医学硕士研究生，研究方向为动物传染病防治。

［通讯作者］赵玉军（１９６１－），男，沈阳农业大学畜牧兽医学院教授，研究方向为动物传染病学。

法库、辽中县所采的猪、牛、羊样品共2400份，应用FMDVRT-PCR试验进行病原检测结果未发现阳性，这一检测方法已广泛应用到日常的病毒检测工作中，为口蹄疫的流行病学研究提供了基础数据。本试验采用的FMDV实时RT-PCR技术，敏感性高，特异性强，操作方便快速，而且不容易造成分子生物学方面的污染，可为口蹄疫诊断、监测、肉品安全检测及研究工作提供有效

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"

鹅副粘病毒病是一种以消化道黏膜散在性或

RT-PCR检测的方法。

1材料与方法

１．１１．２

病毒

鹅副粘病毒株、鹅副伤寒、新城疫

pMD18-TSimpleVector、胶回

病毒株和曲霉菌均由本实验室保存。

主要试剂

收试剂盒均购自大连宝生物公司；DH5α感受态细胞购自北京全实金有限公司；RNA提取试剂、质粒提取试剂盒、高纯质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

１．３引物与探针的设计与合成根据GenBank

公布的GPMV基因的保守序列应用PrimerEx－pressSoftware软件设计一对特异性引物，用于克隆并检测部分为F基因，目的基因长度为1700bp。引物与探针由宝生物有限公司合成，序列如下：

Meq

Forward：5＇-ACCTGTACCTAACC－

GAATTGACTAC-3＇

MeqReverse：5＇-ACCGATTAATGAGCT－GAGTTGATTG-3＇手段。

综上所述，本研究采用口蹄疫NSP-3ABCELISA试验、分子生物学试验（荧光RT-PCR技术）相结合的方法对口蹄疫进行快速监测和诊断，能快速了解全市口蹄疫的感染状况，依靠大量检测数据对口蹄疫发生的风险和流行规律进行分析，这项技术首次在沈阳市应用，取得了很好的预期效果。

2011.05