高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

第33卷第7期2011年7月

中国预防兽医学报

ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine

Vol.33，No.7Jul.2011

doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2011.07.01

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株

感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

张善瑞，周艳君，朱建平，童

武，姜一峰，童光志

*

(中国农业科学院上海兽医研究所/猪传染病研究室，上海200241)

摘要：为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆，本实验根据PRRSVHuN4株基因组

序列设计并合成PRRSV特异性引物，应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSVHuN4株全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScriptⅡSK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4。并在病毒cDNA5'末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本，在3'末段Poly(A)尾引入NotⅠ酶切位点用于线性化pHuN4；此外，将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个MluⅠ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞，并在Marc-145细胞中救获病毒。结果显示：救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变；间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功，而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异。利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验，结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现，发病率达100%，在感染后20d内陆续死亡，表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征，以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆，为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；HuN4株；感染性分子克隆中图分类号：S852.65

文献标识码：A

文章编号：1008-0589(2011)07-0497-06

GenerationofainfectiouscDNAcloneofhighlypathogenicporcine

reproductiveandrespiratorysyndromevirusHuN4

ZHANGShan-rui,ZHOUYan-jun,ZHUJian-ping,TONGWu,JIANGYi-feng,TONGGuang-zhi*

(DivisionofSwineInfectiousDiseases,ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,

Shanghai200241,China)

Abstract:Inthisstudy,ainfectiouscDNAcloneofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)strainHuN4wasgeneratedbycloningofthe6overlappedRT-PCRfragmentsintopBlueScriptⅡSK(+),designatedpHuN4.Inaddition,sp6promoterat5'-terminusandaNotⅠsiteinPoly(A)tailat3'-terminuswereintroducedintothecDNAofPRRSVforviralRNAtranscriptioninvitroandthepHuN4linearization,respectively.Furthmore,theAat14,680ntwasreplacedbyG(silentmutation)togeneraterestrictionenzymeMluⅠsiteasmolecularmarkerforidentificationofrescuedvirus.ThepHuN4waslinearizedandtranscribedinvitro,thetranscriptsweretransfectedprimarilyintoBHKcellsandthenMarc145cells,theviruswassuccessfullyrescuedfromMarc145cellsidentifiedbyindirectimmofluorescentassayandMluⅠdigestion.The*Correspondingauthor

收稿日期：2011-01-12

基金项目：NSFC-广联合基金项目(U0931003)；上海市科技人才计划项目(09XD1405400)；国际合作项目

(2010DFB33920)；国家生猪现代产业技术体系建设项目(NYCYTX-009)；中央科研院所公益性基础科研业务费项目(2011JB03)

作者简介：张善瑞(1980-)，男，山东惠民人，博士研究生，主要从事动物病毒分子生物学研究.*通信作者：E-mail：gztong@shvri.ac.cn