RNAi siRNA shRNA 设计

大量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研

究进展，作为应用RNAi技术时的参考。

1 SiRNA序列的设计

RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设

计和不断的实验检验[1]。

1.1 siRNA序列在靶基因中的位置

从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，

这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。

1.2 siRNA序列的起始碱基与长度

SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)， NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。以AA?N19 标准设计的siRNA，在哺乳动物细胞中70%～80%可产生RNAi 作用。但是一些具有较小脱靶效应的siRNA序列不是以AA为起始的，所以现在不推荐以“AA为起始”作为选择标准之一[6]。最新研究表明[7,8] ，27 nt或29 nt的siRNA与21 ntsiRNA相比：

（1）其抑制活性可提高数倍以上；（2）不易于诱导干扰素反应和激活PKR；（3）一些基因对21 ntsiRNA不敏感，但是可以被27 ntsiRNA有效的抑制；（4）与21 ntSiRNA相比，27 ntSiRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。另外，在选择siRNA 序列时，要考虑到所用启动子的类型。U6启动子要求转录产物的第一个碱基是G，正反义链均如此；

H1启动子转录产物的第一位碱基为U、G、C均不影响基因的沉默效果[9]。