大肠杆菌表达系统的研究进展_戎晶晶

大肠杆菌的研究

药 物 生 物 技 术

416PharmaceuticalBiotechnology 2005,12(6):416~420

大肠杆菌表达系统的研究进展

戎晶晶,刁振宇,周国华

1

2

1,2*

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(1.中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009;2.华东医学生物技术研究所,江苏南京210002)

摘 要 近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。

关键词 大肠杆菌表达系统;表达载体;宿主细胞;重组蛋白

中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1005-8915(2005)06-0416-05

自上世纪70年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统,但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来,有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。1 表达载体1.1 表达调控

构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求,同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成:启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达,然而目的基因在宿主体内过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力,引起相关的细胞应答反应,影响蛋白的活性等。基因组、RNA转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如Lee等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了cAMP-CRP调节蛋白的应答,其中重组子的影响更为强

烈;另外,还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降,而使细胞呼吸活力上升[2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况,通常表达的培养物都是非纯种的细胞群,其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。Deborahat提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析,可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非IPTG或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平,Qing等利用cspA基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold,使目的基因在低温下(<15e)诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。1.2 融合表达载体

除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、OmpA、MalE、PhoA等)表达可以使融合蛋白通过经典的Sec途径分泌到周质或胞外表达,有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和N端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层析的配体来选择,如6-His、GST、CAT、MBP等经过一步亲和纯化可以得到均一性较高的产物,但化学洗脱会对产物的活性产生一定的影响。Ca2+依赖的钙调蛋白结合肽(CBP)

*收稿日期:2005-02-04 修回日期:2005-05-24基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30470454)

作者简介:戎晶晶,1982年生,女,汉族,山西省晋中市人,在读硕士,研究方向:微生物与生化药学

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