生物反应器培养CHO细胞的生长与代谢研究

云南大学学报(自然科学版),2002,24(5):388～392

JournalofYunnanUniversity

CN53-1045/N　ISSN0258-7971

生物反应器培养CHO细胞的生长与代谢研究

孙明波,李卫东,吴炳元,余　华,衡　燮,廖国阳,姜述德

(中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所,云南昆明　650118)

Ξ

摘要:在搅拌式生物反应器中,应用批培养、流加培养和灌流培养3-.3种方法最大活细胞密度分别达到了2.0×106,2.7×106和9.66-1.谢产物氨和乳酸的动态变化进行了检测和分析.结果表明,降低氨和乳酸的产生,提高代谢效率,.

关键词:CHO-k1　　文章编号:0258-7971(2002)04-0388-05

　　CHO-k1,已经表达了许多制品,如UK,t-PA,和乙肝基因工

程疫苗等.利用CHO细胞表达生物制品,是目前生物工程研究的重要课题之一[1,2].生物反应器大规模培养细胞技术的应用,对于用CHO细胞大量制备各种制品有着十分重要的意义.为此,我们用搅拌式生物反应器,采用不同培养方法培养了CHO细胞,对发酵过程中细胞的生长、营养物质代谢等进行了研究,为优化培养条件,探索较为合理的培养方法打下基础.

1.4　培养方法

(1)批培养:培养基中葡萄糖和谷酰胺浓度分

别为17和4.5mmol/L,微载体加入3g/L,细胞接种量为1.5×105mL-1.细胞和培养基一次性加入,培养至138h结束.

(2)流加培养:培养基中葡萄糖和谷酰胺浓度分别为12和2.5mmol/L.流加液含葡萄糖100mmol/L,谷酰胺80mmol/L.微载体加入3g/L.培养至34h开始流加,流加量随培养时间的延长而逐渐增加,由0～1mL/h,培养至158

h结束.

(3)灌流培养:培养基中葡萄糖和谷酰胺分别为12和4mmol/L,微载体加量5g/L.灌流液组分与培基相同,灌流量随培养时间的延长而逐渐增加,由0～84mL/h.1.5　发酵控制　3种培养方法,培养过程中,pH控制在7.2,温度37℃,溶氧40%空气饱和度.接种细胞时搅拌速度为40r/min,24h后逐渐加大到60r/min.1.6　贴附细胞计数　离心管中加入4mL发酵样品,静置片刻,待微载体沉降后,轻轻吸净上清.加入结晶紫染液至4mL,混匀.于37℃放置45min以上.之后摇动使其混匀,稍置片刻,待微载体沉降后,取上清,用血球计数器计数.

1　材料和方法

1.1　设备　荷兰Applikon发酵罐,工作体积2L.

培养时,自动调节氧气、氮气、二氧化碳、空气的混合比例以及碳酸氢钠的加入量来控制溶氧和pH值.

1.2　细胞和培养基　CHO-K1细胞来源于武汉

大学中国典型培养物保藏中心70代细胞,培养时为75～77代.培养基为SigmaDMEM/F121∶1,用时加入体积分数为10%新生牛血清,青链霉素各为100U/mL,根据不同的培养方式加入不同量的葡萄糖和谷氨酰胺.1.3　微载体　使用PharmaciaCytodex-1微载体.

Ξ收稿日期:2002-02-16

　基金项目:云南省科技计划新药专项项目(2000XY05).

),男,云南人,硕士,助理研究员,主要从事病毒疫苗方面的研究.　作者简介:孙明波(1969-