普那菊苣高效再生体系建立和遗传转化研究

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分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

表２根诱导培养基

Ｔａｂｌｅ２Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｒｏｏｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培养基编号培养基成分Ｎｏ．ｏｆｍｅｄｉｕｍＢ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｂ６Ｂ７Ｂ８

Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｍｅｄｉｕｍ１／２ＭＳＭＳＯ

１／２ＭＳ＋Ｃｈａｒｃｏａｌ０．５ｇ／ＬＭＳＯ＋Ｃｈａｒｃｏａｌ０．５ｇ／Ｌ

１／２ＭＳ＋６－ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ１／２ＭＳ＋６－ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ１／２ＭＳ＋６－ＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１．０ｍｇ／Ｌ１／２ＭＳ＋６－ＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ２．０ｍｇ／Ｌ

肠胃炎冠状病毒（ＴＧＥＶ）的糖蛋白Ｓ（Ｓｐｉｋｅ）的Ｎ端结构域（Ｎ－ｇＳ），Ｎ－ｇＳ包含该蛋白质主要的抗原性位点，直接饲喂小鼠，它们也产生了抗糖蛋白Ｓ的特异

抗体。利用植物生物反应器生产动物口服型疫苗受到越来越多的关注。

普那菊苣（ＣｉｃｈｏｒｉｕｍＩｎｔｙｂｕｓＬ．）属菊科多年生宿根草本植物，莲座叶丛生型，原产于欧洲。普那菊苣草质柔嫩，适口性优良，营养丰富，牛、羊、猪、鱼、兔极喜食，国外广泛用于饲料、制糖等原料。普那菊苣适应性广，根系发达，产草量高，营养丰富，含粗蛋白质１６．４４％￣２７．３５％，饲用价值高，是一种很有推广价值的牧草。８０年代末，我国科技工作者从国外引种成功，并且在贵州、四川、河北和山西等地广泛推广种植。目前国内外普那菊苣相关研究多集中在高产栽培技术方面（程林梅和曹秋芬，２００４），而有关普那菊苣组织培养和基因转化方面的研究报道较少。

本实验的目的是构建一个高效的普那菊苣再生体系和转化体系，为利用普那菊苣生产动物口服型疫苗建立初步的技术基础。

Ｔ４ＤＮＡ连接酶、氨苄青霉素、卡那霉素物公司提供，

和羧苄霉素为进口试剂。组培所用试剂和其它试剂均为国产分析纯。

１．２引物设计及ＰＣＲ扩增程序

根据已经测序的绿色荧光蛋白基因序列为依据设计引物：Ｓｅｎｓｅ：５＇－ＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴ－ＧＡＡＴ－３＇，Ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ：５＇－ＧＧＴＡＡＴＧＧＴＴＧＴＣＴＧＧＴ－ＡＡＡＡＧＧ－３＇。ＰＣＲ反应程序：９４℃预变性２ｍｉｎ，然后９４℃３０ｓ，５４℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，４０个循环；最后７２℃１０ｍｉｎ，４℃保存至电泳。１．３愈伤组织诱导和芽分化

将取自大田的叶片用０．１％的升汞处理７￣８ｍｉｎ，无菌水冲洗５次，然后切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的小块，接种于愈伤组织诱导培养基上，１０ｄ后，转移到芽诱导培养基上进行丛生芽的诱导。１．４根的诱导和植株再生

芽长２￣３ｃｍ时，从其基部切下，插入到生根培养基中，进行根的诱导，形成再生植株。１．５成苗的移栽

再生苗长到一定高度，去掉三角瓶的封口膜，在培养室进行一周时间的炼苗，一周后，苗移栽到花盆中，按常规盆栽实验管理。１．６载体构建

１．６．１植物表达载体ｐＢＩ１２１－ＧＦＰ

将连接有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）的克隆载体ｐＵＣ１８，用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切，回收绿色荧光蛋白基因片段，双元植物表达载体ｐＢＩ１２１也通过ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ双酶切回收大片段，二者回收产物

１材料与方法

１．１材料

基本培养基为ＭＳ培养基，ｐＨ５．８。愈伤组织和

芽诱导筛选培养基：ＭＳ＋３％蔗糖＋０．６％琼脂，附加不

ＭＳ＋２％蔗糖＋同的激素（表１）。根诱导筛选培养基：

０．６％琼脂，附加不同的激素（表２）。材料培养在２５℃￣２８℃条件下，光照强度为１３００￣１５００Ｌｕｘ，光照时间为每天１０ｈ。ＤＨ５α、农杆菌ＬＢＡ４４０４（Ｒｉｆ＋）、农杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ＋）、质粒ｐＢＩ１２１（Ｋａｎ＋）由本实验室保存。ｐＵＣ１８（Ａｍｐ＋），带有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）由植保学院杨栋同学惠赠。各种限制性内切酶由宝生生

表１愈伤组织和芽诱导培养基

Ｔａｂｌｅ１Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｂｕｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培养基编号Ｎｏ．ｏｆｍｅｄｉｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ａ５Ａ６Ａ７Ａ８

培养基成分

Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｍｅｄｉｕｍ

ＭＳ＋６－ＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．１ｍｇ／ＬＭＳ＋６－ＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／ＬＭＳ＋６－ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．１ｍｇ／ＬＭＳ＋６－ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／ＬＭＳ＋６－ＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／ＬＭＳ＋６－ＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／ＬＭＳ＋６－ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／ＬＭＳ＋６－ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ