大鼠精原细胞的分离纯化及鉴定

目的精原细胞在精子发生过程中起着重要作用,而精原细胞的分离纯化开展后续研究的基础。实验试图建立大鼠精原细胞的分离纯化方法寻找合适的培养条件。方法用组合酶消化出生9～10 d雄性SD大鼠睾丸组织,利用睾丸体细胞易于和塑料以及胶原介质结合的原理连续贴壁获得精原细胞。结果实验得出每只睾丸提取出的精原细胞数量为5×105个细胞。经碱性磷酸酯酶(BCIP/NBT)显色,阳性率〉90%

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医学研究生学报 2 1 0 0年 6月第 2 3卷第 6期 JMe ot a V 1 2, o, u e 2 1 dP s r, o. 3 N .6 Jn, 0 0 g

一

种操作简便、复性好、重提取纯度较高且花费较低的纯化精原细胞方法，由于 9日龄的 S rge a ly pau D we ( D)鼠睾丸中生殖细

胞主要是精原细胞和支持 S大

夜晾干待用。 123细胞悬液的制备 ..断颈处死 S D雄性大鼠，用

7%酒精浸泡消毒 1 i。在无菌超净台中准备 1 5 0 n m块无菌六孔培养板， 4孔每孑加 6 l D E/ 1,前 L m的 M M F 2第 5孔加 6 l P S最后 1孔加 6m甘氨酸缓冲液。 m的 B, l

细胞，可将提取的生殖细胞悬液通过两步酶消故化，过贴壁培养 4 经 8h去除支持细胞并增殖，经再 过鼠尾 I胶原包被的培养板贴壁培养 4h以进一型

在无菌超净台中取大鼠睾丸，依次放人六孔培养板的第 1孔中，去除被膜和脂肪垫。依次经过 2 3 4 5孔、、、的漂洗后放入第 6孔中，用剪刀将睾丸剪成淤泥状， 时间约 3 i,置 5rn mn静 L。移入已加人 3 I甘氨酸缓 r i 5n l冲液的 5 1菌大试管中，℃ 20Xg离心 5 n 0无 m 4 0 , mi除去上清， D M F2再重复洗 1次。按每 1用 ME/ 1 0只 S D大鼠加入 1 l 0mⅣ型胶原酶 1 g m的比例，7 /l m 3℃

步去除体细胞，从而获得未贴壁的纯化精原细胞。 1材料与方法 11实验材料 .

1 1 1实验动物选用清洁级 9 1 S . . 3龄 D雄性大鼠，重为 1体 8~2,自南京青龙山实验动物繁 0g购殖场，生产单位为扬州大学比较医学中心。实验动物合格证号：C K( ) 0 7— 0 1 S X苏 2 0 0 0。实验用孕鼠在控光条件 (照 1 :0 M一 0 O P黑暗 1 光 4h6 0 A 2:O M, 0h 2:0 M一：0 M)合笼饲养， 00P 60A下出生后挑取健康雄性乳鼠由母鼠哺育至实验所需日龄。选取 l 0只 9日 龄雄性 S D大鼠作为实验动物。 1 1 2实验试剂 1/ l原酶 I 0 2%胰 . . m胶 mg V、 . 5 蛋白酶、 ub coSmoie a l Sm du Ha D lec df d E g e im— m S i e

10rm振荡消化 l 2 i。20Xg离心，去上 0 p 5~ 0mn 0 弃清， D M F 2重复洗涤 3次。按每 1用 ME/ 1 0只 S D大 鼠5 l 的比例加入含 2%乙二胺四乙酸 (ty n i m 5 e l ed. he a iet rat cd E T的

胰蛋白酶，7 0rm m n t ci ai, D A) ea c 3℃8 p

振荡消化 5~1 r n加入 5 l胎牛血清终止消化， 0 i, a l H依次过 20目和 40目筛网， 0 0收集滤液，0 离心， 2 0Xg弃去上清， D M/ 1涤重复 3次。用 ME F 2洗 1 2 4精原细胞的纯化 ..加入含 5 S 1%胎牛%H,0

F 1 du D M. 1 du、血清 ( os .2me im( ME F 2 me im)马 hr e

血清 (e l oieSlm,B ) f a b v e l F S以及碱性成纤维细胞 t n a生长因子 ( ai f rbat r t f t,F F、皮 b s bols go h a o b G )表 ci w cr生长因子子 ( pd r l rwhfc rE F和 1非 e i ma go t t, G ) e ao%

srm,HS、乙基哌嗪乙硫磺酸 ( -一yrx - eu )羟 N 2h doy ehli rz eN eh n— lhncc, E E )盐、 ty p ai -—ta es p o i i H P S p e n u ad

10U ml 0 /青霉素、0 /链霉素以及 I鼠尾胶 1 0 ml U型原均购自美国Sg公司；牛血清购自美国 G b— i ma胎 ii C公司； C P N T碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自 O B I/ B 江苏碧云天生物技术研究所； -i兔抗大鼠多克 C kt

必需氨基酸的 D M/ 1养基，整细胞浓度为 ME F 2培调 1X1。 m接种培养板，4,%C 养 4。将 0/ l 3% 5 O培 8 h包被好 I型鼠尾胶原的培养板置人无菌超净台，加 入 P S洗涤 2次，用。从 C 胞培养箱中取出 B待 O细细胞培养板，心混匀吸取悬浮细胞，0 心，小 2 0Zg离 重新加入含 5 H、0 F S b G、 G% S 1% B、F F E F以及 1%

隆抗体以及山羊抗兔 IG FT g .I C荧光二抗均购自美 国 S naC u公司。 a t rz

1 1 3主要实验仪器冷冻离心机产自 H re s . . eau公司，0 R、 O培养箱产自 H re s司， 40 C: eau公无菌超净台，光倒置显微镜产自日本 N cn公司，光共聚荧 i o荧 焦显微镜产自日本 Oy p s司。 lm u公 12 .实验方法

非必需氨基酸的 D

M F 2培养基，整细胞浓度 ME/ I调 为 1Z 1。m,种于包被好胶原的培养板中， 0/ l接

3￣ 5 O培养 4h其中 2h后用移液器小心混 4C,%C , 匀细胞，继续培养 2。再 h 1 3精原细胞的鉴定 .

1 2 1配制甘氨酸缓冲液 ( 取 1氨酸 . . 1 M) 5g甘

1 3 1细胞活力的测定取 1细胞悬液和 1滴 . .滴

以及 9 0m 5 g的 H P S溶于 1 0m的去离子水， EE 8 l用 0 1 a H调整 p至 7 2再用去离子水调整至 . N O N H ., 2 0m, 0 2 0 l经 . m细菌滤器除菌。

0 4台盼蓝溶液混匀，放 3m n用力摇匀，微 .%静 i,显镜下观察，色透明为活细胞，色为死细胞。无蓝

132细胞形态学观察 .. 按说

①直接用光学显微镜观

1 2 2鼠尾 I型胶原包被无菌六孔培养板 . .

察精原细胞形态；提取的精原细胞经 P S洗涤后② B经 C D ID P M— i A I双染用荧光共聚焦显微镜观察/

明书操作，被浓度为 2 g Cl,包 / l于无菌超净台中过 u l