SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量(垂直板型电泳)

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1． 学习SDS—PAGE测定蛋白质分子量的基本原理。

2．掌握垂直板型电泳的基本操作技术。

二、原理：

由实验十五中已知，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：

因此，测定某个蛋白质的分子量，只需比较它和一系列已知分子量的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。后来，Weber等人基本按Shapiro的方法对约40种蛋白质进行了研究，进一步证实了这个方法地可行性(见图16-1)。用这种方法测定蛋白质的分子量，简便、快速，只需要廉价的设备和微克量的蛋白质样品；所得结果，在分子量为15,000—200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内。因此，近几年来，SDS-凝胶电泳测定分子量的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。

为了阐明SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理，许多人进行了深入的研究。实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4克SDS/1克蛋白质。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪匣烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。

这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。

将蛋白质-SDS复合物在不同浓度的SDS-凝胶中电泳，得到的结果按Ferguson公式作图，也证明了蛋白质-SDS复合物的上述性质。

Ferguson公式：1gmR=1gm0—KRC

该公式原来是Ferguson提出来描述蛋白质在淀粉凝胶中电泳行为的，后来证明它也同样适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，式中mR是蛋白质在一定浓度凝胶（C）中的迁移率；m0是当凝胶浓度外推到零时的迁移率即自由迁移率，它与蛋白质的净电荷量（q）成正比，与蛋白质在溶液中的摩擦系数（f）成反比（m0∝q/f，f由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定）；KR是阻滞系数（retardation coefficient），它与蛋白质分子量成线性关系。因此，不同的蛋白质分子有不同的mR，m0和KR值，几种蛋白质的Ferguson图见图16-2。