蛋白质组学研究的基本步骤

蛋白质样品的制备,蛋白质的分离,蛋白质双向电泳凝胶的染色,双向电泳凝胶图像的采集与分析,蛋白质鉴定。

请简述蛋白质组学研究的基本步骤

1. 蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备是蛋白质组学研究的首要环节，也是最为重要的部分。蛋白质样品的质量直接影响到科学研究的真实性和可信度。 2. 蛋白质的分离：双向凝胶电泳技术是目前最基础和常用的蛋白质分离方法，它能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。双向电泳分为等电聚焦电泳和SDS-PAGE两个步骤，即先进行等电聚焦电泳，按照pI的不同将蛋白分离，然后再进行SDS-PAGE按照分子量的大小不同对蛋白进行分离。IPG胶条的应用，大大提高了双向电泳的重复性。

3. 蛋白质双向电泳凝胶的染色。目前双向电泳凝胶的染色的方法有3种，分别为考马斯亮蓝染色法、银染法和荧光染色法。考马斯亮蓝染色法，操作简便，无毒性，染色后的背景及对比度良好，与下游的蛋白质鉴定方法兼容，但灵敏度较低，可以检测到30～100 ng蛋白质。银染法是一种较为流行的染色方法，银染成本较低，灵敏度高，可检测少到2～5ng的蛋白。荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，而其灵敏度与银染相仿，但线性范围要远高于银染，这使二维电泳分离蛋白质的荧光检测受到普遍关注和应用。

4.双向电泳凝胶图像的采集与分析：图像采集系统通过投射扫描根据吸光度的大小获碍蛋白质点的光密度信息。一般来说，该光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比，以便于软件分析时的定量比较。完成图像采集后采用ImageMaster等图像分析软件进行分析。分析步骤：蛋白质点检测、背景消减、归一化处理、蛋白质点匹配。

5. 蛋白质鉴定：蛋白质鉴定是蛋白质组学研究中的核心内容。目前蛋白质鉴定技术主要有Edman 降解法测序、质谱。质谱是目前最常用的蛋白质鉴定方法。质谱技术的基本原理是带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷之比质荷比( m/z) 的不同而变化，可以据此来判断粒子的质量和特性。质谱完成后利用蛋白质的各种属性参数如相对分子质量、等电点、序列、氨基酸组成、肽质量指纹谱等在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。