兔免疫血清特异性IgG的初步分离纯化的教学实验设计

目的将血清特异性IgG的分离纯化与纯度鉴定实验用于医学院本科实验教学。方法设计家兔特异性免疫血清经硫酸铵盐析,再通过Sephedex G-25凝胶过滤层析,将分离前后的样品分别配制成相同蛋白浓度,分别进行玻片凝集试验和试管凝集试验。结果玻片凝集法分离后的样品凝集现象强于分离前;试管凝集法分离后的样品凝集效价大于分离前。结论成功得到初步分离纯化的特异性IgG。实验操作较

临床和实验医学杂志

21 0 1年 9月第 1 0卷第 1 8期

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兔免疫血清特异性 IG的初步分离纯化的教学实验设计 g 武永红曹励民(西安医学院医学技术系陕西西安 70 2 ) 10 1 设计家兔特异

【摘要】目的将血清特异性 I g G的分离纯化与纯度鉴定实验用于医学院本科实验教学。方法 行玻片凝集试验和试管凝集试验。结果集效价大于分离前。结论

性免疫血清经硫酸铵盐析，再通过 Sp ee e hdxG一2 5凝胶过滤层析，将分离前后的样品分别配制成相同蛋白浓度，分别进玻片凝集法分离后的样品凝集现象强于分离前；管凝集法分离后的样品凝试成功得到初步分离纯化的特异性 IG g。实验操作较为简便，结果稳定，再现性好。通过本实

验学生能更好地理解免疫球蛋白的制备、离纯化的基本方法和过程。分

【关键词】实验教学免疫血清凝胶过滤层析 A ac n pe minto r l n r e r to nd p i c to f t pe m c I G r m he i un e b t e u 1 U 0一 Te hi g Ex r e n p ei mi a y s pa a i n a urf a i n o he s c g f o t n un d Ra bi" s r n . i s y增

hn,A i n Mei lehooydp r etfX" dcnclg. o g C O L—mi, dc cn l eat n inm i oee at g m o a e a l

【 bt c】 0 j te A p i pri,ufao n etctnosei Gfm s u ne r ut t ci xe- A s at r be l pln s a tn pr ctnadi nfao fpc cI o e m tudr a a a n epr cv y g e ao i i i d i i f g r i i r o g d ee h g i me t M e lO s De i n t a p cfc l mmu e a b ts r m,t r u h s lae, e h d x G一2 e le n h o tg a h e a a in,r s e - n . tl d sg h ts e i a l i i y n drb i e u h g uf t S p e e o 5 g lf tr g c r ma o p y s p r t i i r o ep c t e y ma e g t n s mp e n

n e r g td o e n ot e s me c n e tai n,t k l e g l t a ee p rme t nd t b sa gu i a e e p r n . i l k ot a l sa d u s g e ae n s i t a o c n r t v e h o a e si sa gu i t x e d n i n u e g l tn t x e me t a i Re l扭 sl l T e a gu i a e p e o n n o a p e fe e aa in i n i e trt a n e e ae n s t e t e fs mp e fe e a a in g e t r h g i tn t h n me o fs l m l sat rs p r t s e v d n e h n u s g g t d o e;h i ro a ls at rs p r to ae o r t r

h n u s g g t d o e . n l so u c s f l g t ei a y p ri p cf g t a n e e ae n s Co c u i n S c e su l e r l n r u f d s e i cI G.Ex e me tlo e ai n i o o l x,t e u t e sa r y p mi i e i p r n a p r to n t mp e her s l a t— i s c sr b e e rd cbly l,r p o u i i t .Th o g h x e me tsu e t a et r u d rt n h rp r t n s p ai n a d p rf ai n o mmu o lb f a d i r u h t e e p r n t d n s c n b t n e sa d t e p e a a i e a t n u i t f i i e o r o i c o n g o u n, i n t erb sc meh d a d p o e s h i a i t o n r c s .

【 e od】 E pr eteci;m ue e m;e pretnCr a g py K yw rs xe mn t hn Im n r G l e ao ho t r h; i a g su m i m oa

Sp ee ehdx系列凝胶为惰性载体，常不与物质发生兔血清于管中，通逐滴加入饱和硫酸铵溶液 20m。室温 . l化学反应，且不会因吸附杂质造成层析柱堵塞，温度静置 1 i, 00/ i对 0rn 3 0 rmn离心 1 i, a 0m n用移液器小心吸

和缓冲液的环境要求比较宽。使用过的凝胶通过简

单出上层清液 (要含白蛋白 )主。沉淀用 0 5m的蒸馏水 . l的处理便可回收再利用，省了教学资源。凝胶层析的溶解。节 用途有脱盐、分离提纯多种物质 (如酶、白质、基酸、 12 2 Sp ee 2蛋氨 . . eh dxG一 5凝胶柱层析 ... ehdxG一 51 多糖、激素、生物碱等)高分子溶液的浓缩。其中，、凝胶 122 1凝胶的溶胀称取 Spee 2 g置于锥加蒸馏水约 3 l在室温浸泡溶胀至少 3h后装 0m, 层析在蛋白质纯化的生物技术领域得到广泛的应用，随形瓶中，着免疫蛋白类制剂在临床上和生活中的应用价值逐渐柱，或在沸水浴中煮沸 1,出冷至室温后再行装柱。 取 h . ..将引起人们的重视，作为常用制备分离方法的凝胶层析技 1222装柱取层析柱 1支，层析柱下端的死区用蒸馏水充满，不得留有气泡。然后，将层析柱下端的 出口关闭，溶胀后的凝胶用吸管轻轻吸取上清液约 5m l弃掉，使溶液浓缩，用玻棒轻轻搅成悬液，棒一侧插再玻入柱的人口，悬液沿玻棒缓缓倒人其中，将当柱底部凝 m打开出口并调整流速为 0 5mlmi ./ n,年 1月， 1我们在原有实验的基础上，划增加特异性胶沉积至 2a时，计 IG的分离纯化及鉴定的实验内容， g并成功地进行了实切不可太快。不间断地缓缓将凝胶悬液倒人柱中直至验。用饱和硫酸铵溶液可将一球蛋白沉淀析出，除掉沉积的凝胶高度约为 1 m方可停止。凝胶悬液尽量 5a血清中的部分白蛋白和 IM,中绝大部分为 IG g其 g。之次加完，以免出现不均匀与分层的凝胶带。如表层凝后，过凝胶层析可除去大部分盐，具有再次去除白胶凹凸不平时，通并 可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使 一

术也显得越来越重要。用伤寒沙门菌的 H抗原免疫家兔制备特异性抗血清是我校医学技术系已开展近 6年的本科教学实验，激发学生的创造性思维，养学生为培的综合实验设计能力和检验技术综合应用的能力， 1 2 0 0

蛋白和 IM的作用。 g 1材料与方法

表面平整。通过层析 V B:溶液来检测装柱是否符合要求，柱入口加 0 1r ( . gm B的黄色溶液， . n 0

2m/ lV。) l若

Spee 2:离范围 1 0 5 0黄色条带下移时水平而整齐， ehdxG一 5分 0— 0 0 0则层析柱符合要求可以使 K,hrai; D Pa c兔免疫血清； a (0~ 0 a m a 1 m x 2 5 )m玻璃层析用； 否则应重新装柱。 11试剂与器材 .

柱；动部分收集器来自自上海之信仪器有限公司；酶标仪来 12 23加样与洗脱将装有蒸馏水的连通器出水口 .. . 自中国雷杜公司；高速台式冷冻离心机来自贝克曼公司；饱关闭，打开层析柱的出口，使蒸馏水缓缓流出，待凝胶床和硫酸铵溶液；马斯亮蓝 G 002m/￣V 玻璃搅面上只留下约 0 5c的蒸馏水时，考 5 2;. gn B . m关闭出口。用吸管拌棒；℃恒温水浴箱； 3 7紫外分光光度计。 将样品( 04m )约 . 1沿管壁缓缓加到凝胶床的表面。避 12方法 .

免将凝胶冲起。然后打开出口以流速 1 lmn待样品 / i, m 取 2 0 m . l

1 2 1硫酸铵盐析¨获得粗制 IG溶液 .. g

(下转封三 )