DNA甲基化检测

DNA甲基化检测

1. DNA甲基化检测: Southern Blot杂交, Bisulfite Sequencing and

McrBC-PCR

a) Southern Blot

将从四周左右大小拟南芥的莲座叶中提取的DNA，用对甲基化修饰敏感的限制性内切酶酶切后于0.8%琼脂糖凝胶中电泳，参照丁勇师兄总结的方法（具体步骤见下），用湿转法将其转至尼龙膜上，80度真空烤2小时，与探针于65°C杂交16-20小时，经严谨性洗膜后用Phosphoimager进行分析。

PCR primers for amplifying probes:

Promoter of FLC

FLC-P75: CGAGCAAAGGAATGCAAATT

FLC-P42: TTGTGCCTATCTACTTTTTC

hAT Element within MPF

Ty3-p1: ACAATAAAAT GATAATAGTA AGGC

Ty3-p2: CTCACGTTAGTCATGGGTAG

1) 基因组DNA用限制性内切酶酶切后于是0.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳胶图

经凝胶成像集后，将胶于变性液中（1.5M NaCl, 0.5M NAOH）变性45min，再将胶于中和液中（1M TisCL，1.5M NaCl）中和45min。

2) 采用半干转移法用20×SSC为转膜液，将基因组转至尼龙膜上，用紫外交联

器分别交联系30秒，并在80℃下真空干燥2小时。

3) DNA探针用Klenow酶标记，方法为：模板：100-200μg，Random primer:1μl

(500 ng/μl)，5mM dNTP(不含有dCTP): 2μl，用ddH2O补齐为10μl. 99℃变性3-5分钟。冰上放置3分钟。10×Klenow buffer: 2μl，P 32dCTP: 3 μl, Klenow: 2μl,于37℃中放置1小时。再将探针于99℃变性3分钟，冰上放置3分钟后加入杂交管中。

4) 65℃杂交过夜，经2×SSC，0.1%SDS，洗膜两次，每次数10分钟；0.1×SSC，

0.1%SDS，洗膜两次，每次数10分钟后，用Typhoon 8600(Amersham pharmcia biotech)进行扫描。

变性液：1.5M NaCl, 0.5M NaOH

中和液：1M Tris, 1.5M NaCl, pH调至7.2