地表水中浮游植物叶绿素a提取方法的改进研究

实验

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(31):9902-9904责任编辑　理雪莲　责任校对　俞洁

地表水中浮游植物叶绿素a提取方法的改进研究

冯青英1,唐怡2,李丽容3

(1.海南省环境科学研究院,海南海口570206;2.海南师范大学生物系,海南海口570058;3.华南热带农业大学农学院,海南儋州571737)

摘要　[目的]优化地表水中浮游植物叶绿素a的提取方法。[方法]以新配制的90%丙酮为提取液,在低温与室温下反复地冻融浮游植

物以破碎细胞,多次震摇后冷藏静置以提取叶绿素a,并与规范法进行对比。[结果]改进法提取的叶绿素a含量较规范法明显提高,且重复测定的精密度较高。两种方法的测定结果存在明显差异,但在含量测定的趋势上具有较强的一致性。改进法可以满足750nm处吸光值低于0.005的要求,而规范法不能。镜检表明,改进法的植物细胞破碎情况比规范法更佳。[结论]改进法提取浮游植物叶绿素a含量明显高于规范法且重复性较好,具有人为误差小、稳定性好、提取率高、结果准确、操作简便安全等特点。关键词　叶绿素a;反复冻融;细胞破碎率中图分类号　Q946　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)31-09902-03　ImprovementofExtractionMethodofChlorophyllainPhytoplanktoninSurfaceWater

FENGQing2yingetal　(AcademyofEnvironmentalScienceofHainanProvince,Haikou,Hainan570206)Abstract　[Objective]Thestudyaimedtooptimizetheextractionmethodofchlorophyllainphytoplanktoninsurfacewater.[Method]Withnewprepared90%acetoneasextractionsolution,thephytoplanktonwasfrozenandmeltedrepeatedlytocrackthecellsatlowandroomtemperaturesandthenwasfrozentoextractthechlorophyll-aafterrepeatedlyshaking.Thismethodwascontrastedwithnormativemethod.[Result]Comparedwithnormativemethod,thechlorophyllacontentextractedbytheimprovedmethodwasincreasedobviouslyandtheprecisionofrepeateddeterminationwashigher.Therewassignifi2cantdifferencebetweenthedeterminationresultsofthetwomethods,butthestrongerconsistencyinthetrendofcontentdetermination.Theimprovedmethodcouldmeetabsorptionvalue,whichwaslowerthan0.005at750nm,however,thenormativemethodcouldn’tdoit.Themicroscopicexaminationindicatedthatthecrackingconditionofplantcellsbyimprovedmethodwasbetterthatthatbynormativemethod.[Conclusion]TheChlorophyllacontentinphytoplanktonextractedbytheimprovedmethodwassignificantlyhigherthanthatbynormativemethodandhadbetterrepeatability.Itpossessedcharac2terssuchaslittleartificialerror,goodstability,highextractionrate,accurateresult,plesafeKeywords　Chlorophylla;Freezing2thawing;Cellbrokenrate

　　浮游植物中叶绿素a的重要指标,目前,剂的不同,分光光度法分为丙酮法、乙醇法和DMF法[1]等。在《环境监测技术规范》和《湖泊富营养化调查规范》中,均采用丙酮法[2-3]作为常规监测方法。目前,国家环境保护

(第四册)中总局《环境监测技术规范》“叶绿素a的测定方

(下称规范法)在地表水环境监测中应用最为广泛。该法”

方法的研磨过程费时、费力,提取过程繁琐且效率低,转移过程误差大,叶绿素a光降解的加大导致结果偏低。笔者根据有关文献的报道,在实际工作中进行了多次对比试验,对规范法的某些方面进行了改进。1　材料与方法1.1　样品采集　样品采自海南省海口市红城湖,于表层采样,采样量为1500ml。因叶绿素易发生光降解,所以样品采集后应立即用黑色塑料袋遮住。1.2　试验方法1.2.1　规范法。1.2.1.1　样品处理。样品采集后,立即加入1%碳酸镁(每升样品加1%碳酸镁1ml),以防止酸化引起色素波长偏移。1.2.1.2　样品浓缩。装好抽滤装置,在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。加样品前,将样品充分摇匀后进行抽滤,抽滤时负压不能过大(约50kPa)。抽滤时用黑色袋子将样品罩住,样品抽滤后继续抽1～2min。1.2.1.3　样品提取。抽滤完毕后取下滤膜,将样品放入冰

鸣谢　该文得到重庆环境科学院生物组郑坚高级工程师、海南省环境

科学研究院林彰文博士及吴国文高级工程师的指导和帮助,在此由衷感谢!

作者简介　冯青英(1957-),女,海南海口人,助理工程师,从事水质监

测方法改进方面的研究。

收稿日期　2007206207

6h,将滤膜放入研钵,并且加入少

2～3ml90%丙酮,充分手工研磨提取叶绿素a。用离心机3500r/min离心15min,将上清液转入10ml比色管中,最后样品用90%丙酮定容至10ml,摇匀。1.2.2　改进法。1.2.2.1　样品采样和浓缩。与规范法相同。1.2.2.2　提取。抽滤完毕后取下滤膜,将滤膜夹在滤纸中放入-20℃冰箱中冷冻,每隔30min取出在室温中解冻15min,反复冻融[4]3次,使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取。将滤膜放入10ml比色管中,加入新配制的90%丙酮,定容,盖上塞子(在装有滤膜的比色管中先加入1ml蒸馏水再加入9ml丙酮)。振摇1～2min,放入4℃冰箱中静置,每隔30min取出振摇一次,反复操作3次。然后,3500r/min离心15min,将上清液倒入10ml比色管中。1.2.3　测定。采用上述2种方法提取叶绿素a后,取上清液在分光光度计上,用1cm光程的比色皿,分别读取波长750、663、645和630nm处的吸光度,并以90%丙酮作空白。

叶绿素a(mg/m3)=[11.64×(D663-D750)-2.16×

(D645-D750)+0.10×(D360-D750)]V1/Vδ(1)式中,V为样品体积(L),D为吸光度,V1为提取液定容后的

体积(ml),δ为比色皿光程(cm)。2　结果与分析2.1　规范法和改进法测定结果的比较　由表1可知,采用改进法所测得的叶绿素a含量明显高于规范法,且改进法重复测定的精密度较高。这主要是由于改进法简化了试验步骤,避免了样品在研磨和转移过程中的损失。相关性分析结果表明,改进法测定数据与规范法测定数据在0.01水平上显著相关,说明这两种方法在含量测定的趋势上具有较强的一致性。