当前位置： 文档下载 > 所有分类 > 医药卫生 > 2-PCR基因克隆原核表达实验这是我在实验室的PCR基因克隆原核表达实验的具体过程,供有疑问者参考解惑。
第一天：
1、PCR扩增：提前准备超净台工作，在超净台内加样。
PCR反应体系：双或三蒸水至 29.5ul
10×扩增缓冲液 5ul
4种dNTP混合物 5ul
模板DNA 1ul
引物 1、2 各5ul
Taq DNA聚合酶 0.5ul
扩增条件： 根据目的基因长度来定
2、电泳鉴定扩增结果：
配制琼脂糖凝胶（0.2g琼脂糖、20mlTAE溶液），静置至60度左右，加入EB。倒入胶膜成型。加样(250-Marker，2ul DNA样品与1ul buffer混合)，电泳。
3、用试剂盒从扩增液中纯化回收目的片段：加buffer1离心弃滤液、加buffer 2离心弃滤液、加洗脱液洗脱各两次。（buffer1、2有具体名称，忘了） 第二天
1、提取质粒：大肠杆菌菌液离心弃上清，加solution123，静置2分钟后离心取上清，转移至柱子内离心去上清，加bufferAB清洗，离心去上清，加洗脱液洗脱。
2、电泳鉴定提取结果。
3、载体、质粒双酶切：BamHI、XhoI，37度，3到4个小时
3、分别电泳分离载体、质粒酶切后的片段
4、用试剂盒回收目的片段：切胶，加Buffer1溶胶，离心去滤液，加Buffer2清洗，离心去滤液，加洗脱液洗脱。（buffer1、2另有具体名称，忘了）
5、电泳鉴定（省略？）
6、连接、过夜。
7、接种2试管的大肠杆菌37度培养
第三天
1、（超净台）制备感受态大肠杆菌：取4管4ml培养基，分别加入400ul 菌液，200rpm摇床培养至一定浓度。分装至8只1.5mlEP管，冰浴30分种，2管留存。
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